Совсем недавно на сайте нашего семинара д-р Марк Шлянкевич опубликовал очень информативную статью (http://www.elektron2000.com/article/1739.html), в которой были  представлены новейшие достижения в изучении механизмов возникновения различных форм рака и подходов к профилактике и лечению этого «бича человечества». Действительно, последнее десятилетие принесло подлинные прорывы в диагностике и методах лечения различных форм рака, основанные, в том числе, на глубоком изучении и практическом использовании методов иммунотерапии, под которой понимается лечение препаратами, прицельно воздействующими на иммунную систему пациента.  По-видимому, иммунотерапия действительно самый большой прорыв в этой области со времени появления химиотерапии.  И даже появилась надежда, что через несколько лет первая сможет, если не совсем то очень значительно, заменить последнюю. Произойдет это прежде всего за счет того, что появились способы обучать иммунную систему направленно атаковать раковые клетки у конкретного больного.

В продолжении обсуждения темы, которой посвящена статья д-ра Шлянкевича, проиллюстрируем успехи в лечении рака на примере меланомы (рака кожи) – злокачественной опухоли, развивающейся из пигментных клеток организма. Пример выбран не случайно, ведь именно с этим заболеванием пришлось совсем недавно бороться уважаемому редактору нашего семинара (конечно говорю об этом предварительно получив любезное согласие на такое «паблисити» от самого пациента).

К сожалению, число больных злокачественной меланомой растет. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) каждый год в мире диагностируются около 132 тысяч  случаев меланомы. В США меланома находится на пятом месте у мужчин и седьмом у женщин среди самых распространенных видов рака. Смертность от меланомы достигает примерно 15%, причем наблюдаются этнические различия по числу заболевших. Согласно данным опубликованным в США,  меланома диагностируется лишь у одного из 100 тысяч афроамериканцев,  у  4-х латиноамериканцев и у  25 (!) белых, не относящихся к латинос. Причину таких различий очевидно следует искать  на генном уровне, а точнее - в особенностях работы генов, отвечающих за образование специализированных клеток - меланоцитов  в которых происходит синтез пигмента меланина. К счастью у большинства пациентов эта форма рака диагностируется на ранних стадиях, когда болезнь еще может быть излечима. Тем не менее, основной проблемой остается довольно  быстрое ее распространение в результате метастазирования раковых клеток. И хотя до недавнего времени меланома относилась к наиболее грозным опухолям, прогноз для заболевших в настоящее время стал более обнадеживающим, прежде всего потому, что  появилось несколько перспективных подходов к лечению этой болезни. Успех был достигнут также благодаря расшифровке по крайней мере части механизмов, ответственных за внутриклеточную передачу сигналов, ответственных за различные факторы роста нормальных и раковых клеток.

Изучение процессов превращения пигментных клеток – меланоцитов в раковые клетки меланомы привели к открытию механизмов, ответственных за рост и распространение этой формы рака. Меланома неоднородна; ее образование частично зависит от мутаций ДНК, которые приводят к активации онкогенов или их инактивации, а также к различным перестройкам в хромосомах,   определяющим  тип опухоли. К настоящему времени определено несколько путей превращения нормальных клеток в раковые. Наиболее известным из них является так называемый  митоген-активированный протеин киназный (МАРК) [mitogen activated protein kinase (MAPK)], или RAS-RAF-MEK-ERK, путь. Напомню, что митогены это вещества, которые могут стимулировать  начало клеточного деления (процесс митоза), а киназы это особые ферменты, производящие фосфолирирование (присоединение фосфатных групп) определенных аминокислот (серина, треонина и тирозина) в белках-мишенях, необходимое для их дальнейшего участия  в различных биохимических реакциях. Работа тирозин/треониновых МАРК-киназ может быть активирована с помощью различных внеклеточных сигналов. К ним относятся  различные факторы роста (ФР), такие как EGF (эпидермальный фактор роста),  IGF (инсулиноподобный фактор роста) или TGF (трансформирующий фактор роста). Все они индуцируют передачу сигналов (signal transduction)  активирующих  МАРК-киназный путь. Происходит это путем связывания с белками-рецепторами МАРК-киназ, расположенными на поверхности клетки. Это, в свою очередь, приводит к активации белка RAS, который сигнализирует другой группе киназ,  серин/треониновых RAF киназ, представленных тремя белками  A-RAF, B-RAF и C-RAF. Каждая  из этих трех киназ может активировать этап, на котором действуют MEK1 и MEK2 киназы. Следующей мишенью на этом пути служат регулируемые внеклеточными сигналами ERK1 и EКК2 киназы (extracellular signal-regulated kinases). Сигнальный путь ERK (Ras-ERK, MAPK/ERK) относится к ключевым сигнальным кассетам в системе MAPK-сигнальных путей, действующих в нормальных клетках.

Препараты для целевой терапии

Мутации нарушающие отдельные этапы MAPK пути могут привести к неконтролируемому росту неспособных к нормальной дифференциации клеток. Подсчитано, что примерно у 50% больных меланомой обнаруживаются мутации, активирующие  MAP-киназный путь, тогда как от 30 до 72 % больных несут мутации в гене BRAF, причем мутация BRAF/V600K определяется в 5-6% случаях. Способность к подавлению онкогенного эффекта таких мутаций стала одной из желанных целей при создании лечебных препаратов нового поколения для направленной (target) терапии меланомы и некоторых других опухолей.

FDA агентство США одобрило несколько таких препаратов. Разработаны препараты -  ингибиторы для терапии опухолей, Два из них Vemurafenib и Dabrafenib, являющиеся ингибиторами мутантного белка B-RAF, предназначены для лечения меланом на поздних стадиях развития болезни.  Другой препарат, Trametinib (Mekinist), особенно эффективен в случае матастазирующих меланом у больных с особой мутацией V600E в гене BRAF. Мутация эта приводит к замене определенных аминокислот  в белке BRAF, и к нарушению регуляции работы кодирующего его гена. Комбинация траметиниба и дабрафениба, особенно эффективна для лечения больных с мутацией BRAF/V600E, поскольку при совместном использованию значительно удлиняются сроки появления устойчивости к каждому из этих препаратов, в случае если их использовать по отдельности.

Моноклональные антитела.

Для понимания механизма образования опухоли и действия иммунотерапевтических препаратов нужно вспомнить о Т-лимфоцитах или Т-клетках иммунной системы, синтезирующихся в тимусе, или вилочковой железе (отсюда префикс Т перед названием этих клеток). Т-клетки покрыты различными белками-рецепторами, которые являются мишенью для антиген-меченых клеток (antigen presented cells, APCs). T-лимфоциты узнают антиген на поверхности APCs только в комплексе с белками главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, англ. MHC), большой области генома или большого семейства генов, играющей важную роль в иммунной системе и развитии иммунитета. В зависимости от типа антигена и типа молекулы MHC активируются разные виды клеток иммунной системы.

Опухолевые антигены, или неоантигены — это такие антигены, которые «метятся» молекулами MHC на поверхности опухолевых клеток. Такие антигены могут метить опухолевые клетки и никогда - нормальные. Цитотоксические Т-лимфоциты (или Т-клетки убийцы, T-killers), которые распознают такие антигены, могут уничтожить раковые клетки до того, как они начнут пролиферировать или метастазировать. Проблема однако в том, что иммунная система человека и животных примерно в 1000 раз более активна против бактериальных антигенов, чем против так называемых ''неоантигенов''. На поверхности раковых клеток присутствуют несколько неоантигенов, но все они относительно слабо распознаются иммунной системой. Причиной такого различия считается то, что на заре эволюции (более миллиарда лет назад) главной задачей древних живых существ было противодействие бактериальной инвазии. По мере усложнения организмов совершенствовалась и иммунная система, но прежняя упрощенная ''немедленная реакция'' сохранилась как прямой путь к ликвидации вторгшихся микробов. Каждая функционально зрелая T-клетка имеет около 30000 антиген-распознающих рецепторов  (T-cell receptors, TCR) . TCR представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух субъединиц — α (альфа-цепи) и β (бета-цепи), представленных на поверхности клетки и вместе формирующих антигенсвязывающий центр. Субъединицы закреплены в мембране и связаны друг с другом дисульфидной связью. По своей структуре субъединицы TCR относятся к суперсемейству иммуноглобулинов.

Активация Т-лимфоцитов происходит с помощью двух конкурирующих между собой механизмов, один из которых это присоединение АРС к рецептору TCR на поверхности Т-клетки, а другой это взаимодействие белка В7 с рецептором CD28 на поверхности Т-клетки. Присоединение АРС к рецептору TCR служит первым сигналом к их пролиферации и дифференцировке. Однако, чтобы специфически подготовленная клетка вышла в процесс дальнейшего развития, необходим второй сигнал от клеточной поверхности к геному. Ко-стимулятором в данном случае и выступает молекула В7.   Рецептором для В7 на поверхности наивных (т.е. таких, которые еще не вступали в процесс распознавания чужеродных антигенов) Т-клеток и является белок CD28 . В7 и CD28  относятся к супер-семейству иммуноглобулинов. Действуя одновременно эти сигнальные механизмы приводят к активации Т-клеток.   

Наряду с этим существует несколько путей инактивации уже активированных Т-клеток. Для этого нужен белок-рецептор CTLA-4, который тоже умеет присоединяться к В7, посылая тем самым сигнал в ядро, что Т-клетки уж слишком активны и надо бы их притормозить. Но есть и вторая тормозная система, действующая как контрольно-пропускной пункт (checkpoint), останавливающий активность Т-клеток Стражем служит белок-рецептор PD-1, расположенный на поверхности Т-клеток. В случае опухоли рецептор PD-1может связаться на ее поверхности с молекулой-лигандом PD-L1, что может привести к инактивации Т-клеток. Выяснение роли CTLA-4 и PD-1 (или PD-L1) блокаторов иммунного ответа помогло понять каким образом они могут служить мишенями препаратов для лечения опухолей.

Ключевым фактором персонализированной иммунотерапии рака, о которой говорилось в статье д-ра Шлянкевича, является использование моноклональных антител (МКАТ). МКАТ это антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной клетки-предшественницы. МКАТ распознают и связывают антигены для распознавания специфических эпитопов  [частей макромолекулы антигена, которая распознаётся иммунной системой (антителами, B-лимфоцитами, T-лимфоцитами)], которые обеспечивают защиту против болезнетворных организмов или опухолей. В случае использования МКАТ в качестве лекарств их название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»),  а сами препараты МАКТ стали частью метода лечения опухолей, называемого с недавнего времени монотерапией. В недавнее время свою эффективность показали МКАТ, блокирующие рецепторы упомянутых выше факторов роста (ФР) - особых сигнальных молекул, стимулирующих клеточное деление путем активирования МАРК-киназ.  Повышенная активность ФР заставляет раковые клетки делиться намного быстрее, чем нормальные, что в результате приводит к образованию опухоли и ее распространению в организме (метастазированию). МКАТ подавляющие рецепторы ФР сейчас используют для лечения различных форм рака. Так  Cetuximab,  одобренный для лечения рака толстой кишки и рака головы и шеи, представляет собой моноклональное антитело IgG1, направленное против рецептора эпидермального фактора роста раковых клеток (EGFR). Другой препарат, Trastuzumab, назначаемый при  раке молочной железы или желудка, блокирует ферментационную активность белка-рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (human epidermal growth factor receptor, HER2) на поверхности злокачественных клеток и тормозят их размножение (пролиферацию).

В случае меланомы к наиболее существенным успехам относится создание препаратов МКАТ, таких, например, как анти-PD1 антитела (Тivolumab, Pembrolizumab и Nivolumab), используемые для лечения пациентов,  не реагирующих на другие противоопухолевые средства.  Они действует как иммуномодуляторы, способные блокировать связывание с белком-рецептором рецептором  PD-1, препятствующим активации иммунного ответа Т-клеток, позволяя тем самым иммунной системе атаковать опухоли. Подобные препараты как бы стоят на контрольно-пропускном пункте иммунной блокады (immune checkpoint blockade) опухолевого ростаю. К этому же ряду относятся препараты на основе моноклональных анти-CTLA-4 антител (Ipilimumab, или Yervoy, и  Tremelimumab), связывающихся  с рецепторными белками способными нарушить регуляцию иммунной защиты от опухолей. Эти препараты, также одобренные FDA США, рекомендованы для монотерапии поздних стадий меланомы, которая уже не может быть удалена хирургическими методами без опасности метастазирования.   Тем не менее, продолжается работа над новыми возможными методами лечения, поскольку развитие у больных  устойчивости к лекарственным препаратам является обычно наблюдаемой проблемой. О некоторых из них подробно рассказывается в материале, представленном д-ром Шлянкевичем.

Персональные вакцины

Чуть ли не еженедельно в прессе появляются новые сенсационные сообщения об успехах наступления на рак. Буквально в те дни, что я работал над этой статьей в мартовском номере за 2016 год в престижном журнале Science появилось сообщение о впечатляющем успехе группы профессора Чарльза Суонтона (Charles Swanton) из Института рака Университетского колледжа Лондона. Британские ученые утверждают, что нашли способ заставить иммунную систему человека эффективно бороться с раковыми опухолями. Его суть заключается в том, чтобы найти самое уязвимое место каждой отдельно взятой опухоли и нацелить на него иммунную систему. Ученым удалось найти механизмы для идентификации в структуре рака "слабых" участков. Оказалось, что по мере роста опухолей  они приобретают мутации, некоторые из которых создают как бы новые, не характерные для нормальных клеток антигены - неоантигены, а последние влияют на реакцию пациентов на препараты подавляющие «контрольно-пропускные» не пропускающие иммунную систему к опухоли.  Группа Соунтана изучала влияние неоантигенов на противоопухолевый иммунитет у больных раком легких и меланомой. Исследования показали роль опухолевых неоантигенов  в распознавании раковых клеток иммунной системы, что вновь привлекло интерес  к  персонализированным вакцинам  и к клеточной терапии, направленных на раковые мутации. Оказалось, что чувствительность к блокаде упомянутых выше белков-рецепторов  PD-1 и CTLA-4 при использовании МКТА препаратов анти-PD-1 (Pembrolizumab) или анти-CTLA-4  (Ipilimumab или Tremelimumab) повышается в опухолях  обогащенных  неоантигенами за счет накопления соответствующих мутаций в раковых клетках. Соответственно у пациентов показавших хороший ответ на лечение  были обнаружены Т-клетки, способные распознать такие неоантигены и связываться с ними.  Тем самым неоантигены сами могут служить метками, позволяющими МКАТ препаратам прицельно атаковать раковые клетки. 

Это открытие подразумевает индивидуальный подход к каждому отдельному случаю заболевания раком, исследование клеток каждой опухоли, что на практике может стоить очень дорого. Основываясь на  результатах секвенирования ДНК больных различными формами рака, ученые определили какие белки, прикрепленные к поверхности раковых клеток, оказались измененные в результате мутаций в соответствующих генах раковых больных. Измененные белки были выделены из раковой опухоли больного и использованы в качестве антигена, для получения вакцины "запускающей" иммунную систему на борьбу со злокачественными клетками. Следует заметить, что иммунную систему привлекали для борьбы с онкозаболеваниями и раньше, но по большей части все известные вакцины против рака оказались неэффективными. Проф. Соунтон объясняют это тем, что защитные механизмы организма направлялись как бы веерно, без того, чтобы сконцентрироваться на строго определенной цели. Дело в том, что раковая опухоль – это не единое, равномерное образование. Она состоит из совершенно разных, по-разному мутировавших клеток, поэтому и вести себя отдельные участки опухоли могут по-разному.

Раковую опухоль можно сравнить с медузой. У нее есть как бы ствол (тело), содержащий первичные мутировавшие раковые клетки, а от него отходят щупальца, в каждом из которых находятся клетки, в которых проходят свои мутационные процессы. Прорыв группы Соунтона  заключается в том, что они научились распознавать в клетках ствола мутации, которые изменяют антигены – белки, расположенные на поверхности опухолевых клеток. Для воздействия на мутации в "стволе" авторы предлагают  либо разработать индивидуальную вакцину для каждого пациента, которая поможет иммунной системе их распознать, либо найти в организме иммунные клетки, которые уже распознали и атаковали мутирующие клетки, размножить эти иммунные клетки в лабораторных условиях, получив моноклональные антитела,  и поместить обратно в организм. Коллега профессора Соунтона Марко Герлингер (Marco Gerlinger) исследующий процессы эволюции опухолей в том же  Институте изучения рака в Лондоне отмечает что « многие виды раковых опухолей не стоят на месте, они постоянно эволюционируют. Это движущиеся цели, по которым непросто попасть.  Рак, который все время меняется, может "сбросить" первоначальный антиген или замаскировать другие антигены, чтобы сбить иммунную систему с толку". Снять иммунную систему с тормозов и направить ее на направленное уничтожение раковых клеток – задача препаратов, используемых в иммунотерапии опухолей.

Предложенный метод как бы доводит персонализацию иммунотерапии до некоего абсолюта, где каждый пациент будет иметь возможность получить уникальные, сделанный на заказ препараты. Решение такой задачи предполагает два похода. Первый заключается в разработке вакцин против рака для каждого пациента,  резко усилив специфичность иммунной защиты от опухоли. Пациенту будут вводить вакцину, изготовленную на основе антигенов, извлеченных из его собственной опухоли. Такая вакцина сможет активировать иммунную систему этого конкретного больного на борьбу с раковыми клетками. Во-вторых, появляется способ «выуживать» иммунные Т-клетки, которые уже способны распознать мутантные белки-мишени, размножить эти Т-клетки в лаборатории, а затем вернуть их обратно в организм больного. «Для каждого пациента по сути будет разрабатываться уникальный метод лечения" - заявил профессор Суонтон. По-видимому, это самые обнадеживающие результаты в области иммунотерапии за последние годы. Это означает, что пациенты с диагнозом меланома и другими формами рака имеют теперь возможность получить персонализированное лечение, которое никогда не применялось ранее.       

Тем не менее, в заключение хочу упомянуть еще одну перспективную разработку. Как уже отмечалось выше, неоантигены, или раковые белки (маркеры), расположенные на поверхности раковых клеток, относительно слабо распознаются иммунной системой. Последняя зато заметно более эффективна  в отношении антигенов различных патогенов, например, бактерии известной как золотистый стафилококк (лат. Staphylococcus aureus). Поэтому начата работа по получению суперантигенов (Superantigens, SAgs), представляющих гибридный, или слитный белок (fusion protein), в котором имеется два компонента – бактериальный антиген стафилококка и участок моноклональных антител, узнающий специфический раковый неоантиген. Отличительной особенностью суперантигенов является способность напрямую связываться с  бета-цепью антигенсвязывающего центра TCR, что вызывает активацию Т-лимфоцитов минуя стандартный механизм взаимодействия антигенов с TCR. Шведский препарат ANYARA является суперантигеном, где в качестве антигена (мишени) использован белок 5T4, который продуцируется только на эмбриональной стадии развития почек и некоторых других тканей (oncofoetal antigen). Обычно белок 5T4 находят на поверхности раковых и почти никогда нормальных  клеток. Считается, что он участвует в метастазировании опухоли. Клинические испытания показали действенность ANYARA при раке почек. Комбинированное применение ANYARA и anti-CTLA-4 препаратов [например упоминавшихся ранее Ипилимумаба (Ipilimumab, или Yervoy) или Тремелимумаба (Tremelimumab)] повышает эффективность лечения  меланомы, устойчивой к другим видам иммунотерапии. Подробнее об этом можно посмотреть на сайте компании  Active Biotech, Lund, Sweden (http://www.activebiotech.com/anyara-the-targeted-cancer-therapy).

Автор выражает благодарность д-ру Марку Шлянкевичу (Йельский университет (Yale University), США за ценные советы при подготовке данной статьи.

Литература

Niezgoda et al. (2015)  Novel approaches to treatment of advanced melanoma: a review on targeted therapy and immunotherapy. BioMed Research International, vol. 2015,  doi:10.1155/2015/851387 (обзор последних достижений в лечении меланомы).

Мнение эксперта. Профессор Питер Джонсон (Peter Johnson) об иммунотерапии рака. http://scienceblog.cancerresearchuk.org/2015/09/17/expert-opinion-professor-peter-johnson-on-cancer-immunotherapy/ (просто и доходчиво, даже с анимацией объясняется, как специфичные моноклональные антитела помогают обойти контрольно-пропускные пункты (checkpoints) мешающие Т-лимфоцитам распознать и атаковать раковые клетки).

Р. Нудельман. Иммунные клетки за школьной партой, «Окна», приложение газеты «Вести» за 3 марта 2016 года (образец научно-популярного рассказа об успехах мировой, в том числе и Израильской,  науки в иммунотерапии рака)