понедельник, 18. января 2016 - 18:55

Ведущий американский журнал Science назвал применения CRISPR/CAS9 главным научным прорывом 2015 года. Журнал Nature посвятил этим применениям огромную подборку в одном из предновогодних номеров, поставив их рядом с полетом к Плутону. Сравнительная таблица, опубликованная в одном из обзоров, демонстрирует головокружительный взлет числа публикаций по этой теме: 277 в 2013 г., 364 в 2014 г. и около полутысячи в 2015-м (из них 150 с лишним в США, более 120 в Китае за 50 - в Канаде, Великобритании, Германии и Франции – за 50; по России данных в таблице нет). Многие специалисты называют CRISPR/CAS9 фантастическим подарком эволюции. В то же время другие считают его самым опасным ее подарком. Что же это такое - CRISPR/CAS9?

Это громоздкое название (произносится «Криспер») укрепилось за особым методом, с помощью которого древнейшие одноклеточные организмы: бактерии и археи – защищаются от вирусов-бактериофагов. Иными словами, это бактериальная иммунная система. Она отличается от иммунной системы млекопитающих. У нас, как известно, есть два механизма защиты от патогенов. Один вид этой защиты – т.н. врожденный иммунитет: часть наших иммунных клеток обладает способностью распознавать (и уничтожать) многие классы чужеродных клеток (патогенов) даже до первой встречи с ними, просто благодаря «древней памяти» о каких-то общих приметах того или иного класса. Второй вид – иммунитет приобретенный, который вырабатывается у других наших иммунных клеток после их первой встречи с тем или иным специфическим патогеном и на всю жизнь остается наготове, чтобы отразить повторную его атаку (этот иммунитет можно выработать и искусственно, с помощью вакцинации).

У бактерий некое подобие врожденного иммунитета осуществляют белковые молекулы, именуемые «нуклеазами типа Cаs». Когда бактериофаг «впрыскивает» в бактериальную клетку свою ДНК, чтобы с ее помощью там размножаться, эти молекулы атакуют ее и разрезают на части, тем самым защищая бактерию. Но защита на этом не кончается. Как открыли биологи, один из кусочков разрезанной таким образом фаговой ДНК бактерия «прячет про запас»» в своей собственной ДНК, чтобы использовать для защиты в будущем. Когда такой фаг снова атакует ее, впрыскивая свою ДНК, она срочно делает копию хранимого кусочка в виде одноцепочечной молекулы РНК, «пришивает» к этой копии молекулу Cаs9 и высылает этот комплекс навстречу фаговой ДНК. Копия находит в фаговой ДНК соответствующее себе место, «приклеивается» к нему и тогда Cаs выполняет свою роль «ножниц» - разрезает фаговую ДНК в этом месте, и та гибнет.

Таким же образом бактерия запоминает и другие бактериофаги, каждый в отдельности, с помощью кусочка, вырезанного из его ДНК. Каждый такой кусочек (он получил название «спейсер») втягивается затем в бактериальную ДНК и встраивается в неё. Все такие спейсеры встраиваются в одном и том же определенном участке бактериальной ДНК, специально отведенном для хранения таких «памяток». Чтобы не спутать потом «спейсер» от одного фага со «спейсером» от другого, между ними остаются «водоразделы» - небольшие участочки бактериальной ДНК, причем особого вида: одна половина каждого такого участочка повторяет вторую половину в зеркальном отражении; эта зеркальная пара получила у ученых название «повтор» (repeat), потому что она повторяется после каждого спейсера. В целом образуется этакий «склад памяток», легко распознаваемый в ДНК бактерии по своему особому строению: спейсер-повтор-спейсер повтор - и так далее, до конца «склада».

Когда в 1987, а потом в 2000 годах ученые впервые обнаружили этот особый участок в ДНК бактерий (и дали ему название CRISPR, означающее что-то вроде «сгруппированные зеркальные повторы, разделенные спейсерами»), они сначала не поняли, что это такое. Но в 2002-2005 году выяснилось, что криспер связан с семейством молекул - «ножниц» класса Cas, а его спейсеры подобны кусочкам ДНК разных бактериофагов, и тогда стало ясно, что криспер может играть роль бактериального механизма приобретенного иммунитета. Этот иммунитет, в отличие от нашего, может даже передаваться дочерним бактериям (не случайно биолог Кунин назвал его «ламарковским»), но он довольно примитивен, потому что «склад памяти» имеет ограниченную длину, и когда он заполняется, новый кусочек по необходимости вытесняет самый ранний старый, и получается, что бактерия приобретает иммунитет к новым фагам за счет утраты иммунитета к ранее встреченным.

А затем оказалось, что этот «примитивный» механизм можно легко превратить в очень гибкий, многоцелевой - в то же время быстрый и дешевый - метод генной инженерии. В 2012 году американка Дудна и француженка Шарпентье, объединив усилия, детально выяснили весь процесс «наводки» комплекса CRISPR-Cas9 на «чужую» ДНК и показали, что такой комплекс легко создать искусственно для любой ДНК, которую исследователь хочет разрезать в каком-то определенном месте, причем разрезать можно, по желанию, одну «нить» двухцепочечной ДНК или сразу обе нити. (Почти одновременно аналогичный результат получил 24-летний Фред Джанг из МИТа в Бостоне). Это имело важное значение. Поскольку ДНК играет центральную роль в клеточной жизни, в любой клетке есть механизм починки ДНК – особые белки, которые, распознав разрыв ДНК в каком-то месте, тут же доставляют к этому месту соответствующие ему запасные звенья и с их помощью строят «заплату». Но механика этого «латанья» устроена так, что при разрезе двух цепей ДНК часть звеньев в разрезанном месте теряется, и если это ген, то возникает возможность убрать в нем какой-то участок или весь ген вообще. а при латании одной нити в разрезанное место можно встроить новые звенья, и это открывает принципиальную возможность встроить туда новый ген, доставленный каким-то путем извне. Перспективы, которые это открывало, были головокружительны. Ну, вот первый пришедший в голову пример – болезнь Хантингтона. Если в гене НТТ на 4-й хромосоме три определенных звена повторяются не более 35 раз, человек остается здоров; если до 40 – заболеет, но не раньше 50 лет; и чем больше повторов выше сорока, тем раньше заболеет и раньше умрет. Ясно, что имея в руках криспер, можно, в принципе, вырезать лишние повторы и спасти обреченных. Ошеломительные перспективы генной инженерии.

Надо сказать, что о генной инженерии биологи говорят уже много лет, с тех пор, как были открыты первые виды белков, способных разрезать ДНК, а это было задолго до нуклеаз. Затем был создан первый практический способ такого разрезания – с помощью т.н. «цинковых пальцев». Каждый из этого богатого семейства белков оказался способен распознавать группу из трех каких-то звеньев ДНК. Присоединив к ним нуклеазу Foc1, можно было разрезать ДНК в этом месте. В 2009 году было найдено, что «цинковые пальцы» в роли «наводчика» можно успешно заменить белком TAL, соединенным с некой нуклеазой – такой комплекс (TALEN) хорош тем, что распознает отдельные звенья в ДНК и в сочетании с Foc1 может разрезать ее более точно, чем «цинковые пальцы». С тех пор эти два метода вошли в биологию, и с их помощью уже были улучшены (в пробирке) гены некоторых растений и человеческие иммунные клетки, а также исправлена (тоже в пробирке) генетическая мутация, ведущая к серповидно-клеточной анемии.

Однако оба метода неточны: их комплексы очень часто разрезают ДНК не в том месте или же во многих сходных местах сразу, что ведет к гибели ДНК и всей клетки. Криспер тоже страдал поначалу такой неточностью, но в декабре 2015 года группа Джанга показала, что изменение всего трех (из 1400) химических групп в структуре комплекса CRISPR-Cas9 делает точность наводки и разрезания практически 100-процентной! За эти же три года, прошедшие со времени создания нового метода, были найдены также другие молекулы, способные заменить Cas9 в роли «ножниц» (Чанг, Кунин); разработаны простые пути искусственного создания направляющей молекулы РНК (Джинек) и доставки этих комплексов в нужные клетки с помощью т.н. «плазмидов» (кольцевых кусочков ДНК, посредством которых бактерии передают друг другу генетическую информацию, распространяя, например, резистентность к антибиотикам); и, наконец, был создан метод т.н. ген-драйва, позволяющий быстро распространить нужный ген, подсаженный в одну особь, по всему поголовью.

Перечислить все достигнутые этим методом результаты невозможно: к концу 2014 г. соответствующих работ набралось около 600, а в 2015 к ним, как уже говорилось, добавились еще полтысячи. Поэтому назову лишь несколько самых революционных. В декабре 2015 г. было сообщено, что в работе со свиными эмбрионами удалось «выключить» сразу 62 (!) вредных гена, мешавших до сих пор безопасной пересадке свиных органов людям. Это были гены, имеющие тенденцию «гулять» по свиной ДНК и портить ее собственные гены; понятно, к каким нежелательным последствиям может привести их пересадка в человека. Теперь эта угроза устранена. Другой сенсационный результат был достигнут в деле борьбы с малярией. Известно, что ее переносят комары, заражающиеся т.н. малярийным плазмодием. И вот теперь исследователям удалось не только изменить (с помощью CRISPR-Cas9) гены нескольких комаров так, что плазмодий уже не может их заражать, но и – с помощью «ген-драйва» - распространить это благодетельное для людей свойство разом на 97%! всего комариного поголовья в инсектарии.

Еще один перспективнейший результат получили ученые, изучавшие человеческие иммунные клетки из класса Т-клеток. Именно эти клетки первыми подвергаются атаке вируса СПИД: на их поверхности есть, к несчастью для нас, такой белок-рецептор, к которому ВИЧ (вирус иммуннодефицита человека) имеет врожденное сродство, т.е. может на него садиться и с его помощью проникать в клетку, убивая ее (отсюда и последующий иммуннодефицит). Так вот, с помощью того же «криспера» удалось модифицировать ген этого рецептора так, что сам рецептор стал недоступен для вируса. И наконец, самое, пожалуй, сенсационное – китайским исследователям, работавшим с нежизнеспособными человеческими зародышами удалось существенно улучшить человеческую генетику, «подправив» некоторые гены, что, в принципе, говорит о возможности «практической евгеники», т.е. направленного улучшения человеческой природы с помощью генной инженерии. Все это удалось сделать только благодаря появлению метода CRISPR-Cas9, потому что он необыкновенно – в десятки, а то и в сотни раз! – удешевляет и ускоряет весь процесс: исследования, которые раньше длились бы годами и стоили миллионы, теперь делаются за месяцы и за десятки тысяч. Это впервые делает практически возможными те многочисленные проверки генной инженерии, которые требуются для ее перенесения на людей, - и не случайно в первые научные фирмы-стартапы (Editas и др.), созданные в этой области, уже вложено около миллиарда долларов. Один из биологов замечательно охарактеризовал все эти фантастические достоинства нового метода, сказав, что с его помощью можно менять гены и создавать новые свойства даже в простом гараже, переоборудованном под лабораторию.

Насколько это также чудовищно опасно, понятно, наверно, каждому. Если генная инженерия станет такой же вседоступной, как Интернет, то ждать трагедий придется недолго. Начнется с частных или подпольных фирм, обещающих людям желанную «генетическую косметику», и кончится лабораториями в руках прямых злоумышленников разного толка. Ученые уже осознали эту опасность. Они уже бьют тревогу и созывают конференции для выработки соответствующих ограничений на эксперименты. Сумеют ли они удержать джина в бутылке, покажет будущее. В случае Интернета, как мы видим, не сумели.

Рафаил Нудельман
"Окна", 7.1.2016